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癌症靶点研究有哪些不靠谱?诺奖得主指出常见问题

2019年的诺贝尔生理医学奖得主William G. Kaelin Jr教授曾于两年前在《自然》发表综述,指出当今癌症药物靶点研究的弊端,并提出相应的解决方案,其中的一些见解也适用于生命科学其他领域的研究。
 
撰文 ∣ William G. Kaelin Jr 编译 ∣ 李娟
 
识别药物靶点并检验其有效性是抗癌药物进入临床前研究的关键。目前,有关癌症靶点的最新研究层出不穷,但良莠不齐,存在不少问题,比如结论无法被重复验证、数据分析逻辑欠佳等。本文就癌症靶点验证研究中普遍存在的缺点及可能的解决方法做出阐明。
 
 
必要性与充分性
 
随着癌症研究数据的爆发出现,在挖掘有意义结论的过程中,区分相关性和因果关系是至关重要的。生物学中有许多例子:两个相互关联的事物并不存在因果关系,有时是因为二者都处于上游控制因素之下,有时二者只是偶然相关。
 
在描述因果关系时,有两个词特别有用:必要性和充分性。甲对乙是必要的,意味着如果甲不存在,乙就不可能是真的;甲对乙是充分的,意味着如果甲是真的,乙也会是真的--这对得出符合逻辑的结论是非常关键的。
 
例如,在恶性黑色素瘤中首次发现BRAF突变时,一些人认为BRAF突变不是好的药物靶点,因为其在良性痣中也存在。但这仅表明BRAF突变不足以引起恶性黑色素瘤,临床上我们更应看重的是BRAF的活性是否是BRAF突变黑色素瘤发展所必需的,这个问题现在已经得到肯定的回答。
 
此外,多重基因突变往往是癌症发生发展的必要条件,但并不说明必须联合使用靶向每个突变的药物才能充分治疗癌症。比如,尽管还存在其他诱发因素,但是在p53突变的肿瘤中恢复p53的功能就足以诱导癌细胞凋亡。联合用药的原因常是出于对耐药性的考量。因此,研究者一定要清晰地判断必要性和充分性,得出恰当的因果关系。
 
与不良预后相关的靶点判定
 
无法正确判断因果,就容易曲解癌症新药靶点的研究数据。例如,当发现某个靶点的表达与患者的不良结果相关,研究者表述结论时常暗示不良结果是该靶点引起的--这是不合理的。举个例子,就慢性肺病患者来说,需要呼吸机的病人相比不需要呼吸机的病人来说,病情往往更严重、表现更差,但解释数据时我们肯定不会认为这是呼吸机引起的。相反,需要呼吸机标示着病情发展到了更晚期的阶段。
 
在癌症生物学中,许多分子水平的变化与癌症侵袭性的增加有关,但这些分子不一定就是导致癌症侵袭性的原因。例如,缺氧诱导因子 (HIF) 的上调表达总是与患者的不良预后相关,这既可能意味着HIF导致某些肿瘤更具侵袭性,但也可能意味着,肿瘤生长缺乏血氧供应,才使得HIF上调。在后一种情况下,缺氧、缺氧诱导因子和不良预后之间存在因果关系,但因果关系方向与前一种推断正好相反。再如,雌激素受体(ER) 阳性的乳腺癌患者比ER阴性的患者的预后更好,并不是因为ER抑制癌细胞生长,而是ER驱动的乳腺癌比其他亚型更具惰性。事实上,ER是最有效的癌症治疗靶点之一。
 
总之,一个因素与不良预后相关,并不足以判断它是否能作为癌症治疗的靶点。即,与不良预后相关,并非选择靶点的必要且充分条件。
 
相关性+合理性≠因果关系
 
那么,两个事物之间的因果关联是如何确定的呢?通常是去干扰一个事物,同时测量另一个事物受到的影响。例如,当使用遗传或化学方法破坏蛋白A的功能,导致表型B丧失,说明蛋白A的活性对于B是必需的。当激活蛋白A,总是产生表型B,说明对于B来说,A是充分的。当然,这类实验并不能区分直接影响和间接影响,其机制将通过生化研究或结构研究得以补充。
 
然而,我们在文献中常见到基于生物学上的合理性对因果关系进行推断--"甲与乙相关,甲导致乙是合理的,因此甲导致乙。"例如,有论文做出结论说:"高水平HIF与癌症不良预后相关,很可能是高水平的HIF上调了那些促进血管生成的基因和肿瘤侵袭的基因,如血管内皮生长因子A (VEGFA) 和基质金属蛋白酶 (MMPs) 。"但是,这个论点忽略了HIF也上调抑制蛋白合成的基因和促进自噬的基因,而这类基因又是可以抑制肿瘤的。事实上,在某些模型中HIF促进肿瘤生长,在另一些模型中则抑制肿瘤生长。
类似地,癌症靶向药物发挥作用时,并不代表药物一定是通过抑制其预期靶点来杀死癌细胞的。例如,在临床前模型中,MELK(母体胚胎亮氨酸拉链激酶)的小分子抑制剂能较好地抑制肿瘤增殖,因此进入临床试验,制成抑制剂药物。然而Sheltzer等最近发现,当用CRISPR- Cas9去除细胞模型中的MELK,细胞仍然能够存活,而且还能对至少一种MELK抑制剂保持敏感,这显然表明该抑制剂药物并不是通过抑制MELK杀死细胞的。可见,基于相关性和合理性来推断因果是不恰当的。
 
上行表型分析更有说服力
 
在癌症生物学和癌症药理学进行表型分析时,必要性和充分性的概念也非常有用。
 
表型分析可以分为"上行分析" (up assays) 和"下行分析" (down assays) 两类。在上行分析中,人们找的是被测读数的增加,例如酶活性的增强或细胞适应性的增强,而在下行分析中,人们找的是被测读数的减少,例如被测蛋白水平的降低或细胞适应性的降低。
 
在提供生物学见解方面,上行分析通常优于下行分析,因为上行分析的信噪比更优,假阳性更少。对于给定的表型来说,必需的东西越多,该表型就越容易被损害。换句话说,降低系统性能的方法要比提高系统性能的方法更多。出于这些原因,进行高通量化学筛选和基因筛选的生物学家往往更喜欢上行分析。
 
然而,癌症科学家使用的表型分析几乎总是下行分析。例如,干扰癌细胞中特定蛋白质的功能,会降低细胞的生存力、增殖力、侵袭力或致瘤性(图1)。但我们同样需要知道,任何降低细胞内稳性或适应性的因素都可能催生上述下行结果。
图1 癌症生物学和癌症药理学中常用的下行表型分析。a, 基于分析物(蛋白质或磷酸表位)水平下降的药效学试验。注意如果分析物的半衰期短于正常对照(通常情况下),分析物水平的下降可能与特异性毒性药物无关,且会导致转录或翻译的整体下降。b, 细胞增殖实验。c, 细胞活性实验。d, 体外血管生成实验。e, 体外细胞侵袭实验。f, 体内肿瘤发生发展实验(如皮下异种移植)。g, 体内肿瘤转移实验(如尾静脉注射肿瘤细胞后进行的实验)。
 
那么,癌症生物学的研究可以实现上行分析吗?答案是肯定的。目前,很多癌症药效学实验是基于分析物(例如磷酸表位)的下调,那么,找到药物与靶点接触时快速诱导升高的分析物,就可以成为药效上行分析的依据。类似思路也适用于癌症生物学的化学和基因筛选实验。如果某个信号通路在正常细胞中致癌,但在报告细胞中抑癌或降低细胞适应性,那么就可以在报告细胞中通过上行分析来筛选抑制剂,而所用报告细胞可以是自然存在的也可以是经过分子工程改造的。
 
此外,癌症科学家通常使用化学物、siRNAs、shRNAs和sgRNA等来干扰癌细胞中特定靶点的功能,最终产生的表型既可能源自于干扰物对靶点的影响,也可能源自于对非靶点的影响,甚至对两者的共同影响。在细胞分析中,当发现某一干扰物导致下行表型时,应该同时考虑是否存在破坏细胞适应性的非靶点效应。干扰物可能达到了预期的药效学结论,并且产生了生物学合理的表型,但是这并不证明干扰物是通过结合靶点而导致该表型的--这是基于相关性和合理性推断因果关系的又一个反例。
 
癌症科学家需要明确一点:要证明因果关系,需要更多的步骤。
 
表型拯救实验
 
表型拯救实验是证明药靶因果关系的经典实验。例如,甲磺酸伊马替尼是ABL激酶活性抑制剂药物,它通过抑制致病性BCR-ABL融合蛋白来杀死慢性髓性白血病 (CML) 细胞,而该药物靶向作用的证实,则来自带有BCR-ABL突变体的CML细胞产生耐药性的证据。
 
制备耐药靶点突变体的方法有数种。例如,将表达靶点的哺乳动物cDNA载体导入特定大肠杆菌中用以积累错义突变,然后将随机突变的表达载体库导入对药物敏感的哺乳动物细胞系。加药后,筛选并扩增抗性细胞克隆,再对相应的表达载体进行测序,之后进一步测试鉴定出的突变体是否确实拮抗药物的生化作用,或者将突变体导入幼稚细胞之后观察能否产生抗药表型(图2a)。
 
Tarun Kapoor及同事开发了一种鉴定耐药突变体的方法,该方法不需要事先了解相关药物靶点。Deepak Nijhawan及同事进一步优化了该方法。在优化方法中,他们用药物去处理充满错义突变、存在天然错配修复缺陷的药物敏感细胞,筛出抗性细胞并克隆扩增,再进行RNA-seq和全外显子测序,以鉴定潜在的耐药基因并加以验证(图2b)。如果天然存在的MMR缺陷细胞系对所研究药物不敏感,或者其生物学特性不适合该方法,原则上可通过CRISPR-Cas9技术制备MMR缺陷细胞 (删除一个或多个MMR基因) 。类似的,Stephen Jackson及同事也报道了利用化学诱变单倍体哺乳动物细胞来鉴定耐药靶基因的方法。
图2 制备耐药突变体的方法
 
在应用遗传干扰物如siRNA、shRNA和sgRNA的实验中,可同时导入表达靶点cDNA的载体来进行表型拯救。所用载体需不含干扰物结合位点,对干扰物不敏感。另一种逆转靶点表型的方法是恢复靶点下游的效应子功能。例如,激活BRAF下游的MEK1,可以使BRAF突变黑色素瘤细胞对BRAF抑制剂产生抗性。在这类表型拯救实验中,事先了解靶点下游效应子及其功能是非常重要的。
 
为了进一步明确功能丧失(或功能获得)是遗传干扰物作用于靶点所致,还可以测试相应的功能获得(或功能丧失)实验是否会导致相反的表型。例如,如果敲除靶点能够抑制肿瘤生长,那么过表达靶点则会促进肿瘤生长。但要注意一些靶点的表型效应可能与其表达水平或活性强弱没有线性关系。
 
如果上述表型拯救实验失败,很有可能说明药物存在非靶点效应。但是,我们需要知道,成功逆转某些表型可能还需要满足其他条件,比如导入的外源靶点必须达到内源靶点的丰度,并符合生理调控过程(例如细胞周期特异性调控)。解决这个问题(至少在蛋白质丰度方面)的一种方法是,将外源靶点基因置于可调控的启动子之下,然后使用CRISPR-Cas9删掉内源靶点表达。另一种方法是用含有靶基因顺式作用调节元件的细菌人工染色体(BACs)进行拯救实验。
 
在表型拯救实验中,为了明确表型与靶点的因果关系,排除非靶点效应,有必要使用多种试剂进行检测,比如用多个独立的shRNAs或用化学试剂对遗传试剂进行补充。使用不同种类的试剂得到互相佐证的实验结果,或者通过动物模型加强细胞模型的结果,会让癌症靶点验证研究更具说服力。
 
此外,更合理地设计阳性对照和阴性对照,对解释证明药靶的因果关系也非常重要。
 
肿瘤动物模型的使用
 
癌症靶点研究的一大挑战是确定临床可耐受的最终药物剂量,达到抑制肿瘤生长、理想情况下消退肿瘤的目的。为此,人们常用到肿瘤异种移植实验,而这类实验中常被忽视的一点就是用药的时机。
 
在肿瘤细胞移植之前、移植时或移植后立刻应用药物,都可能会高估药物靶点在肿瘤维持中的作用。例如,注射到免疫缺陷小鼠体内的106个肿瘤细胞必须经过至少10次倍增才能达到1cm3的荷瘤大小,如果用药时机过早,使细胞增殖变缓,那么同一时间段内细胞的9次倍增就能让荷瘤生长减少50%,而这一"好"结果其实是夸大的。
 
因此,理想情况下,应在已建好的荷瘤模型上使用药物,尤其是肿瘤转移模型。
 
另外需要注意的是,在免疫缺陷小鼠中引起肿瘤生长停滞的药物,在免疫正常小鼠中,可能会使肿瘤发生消退。
 
预测毒性
 
新的癌症靶点药物的发现常因潜在的毒性而被批评或否认,比如该靶点对维持正常胚胎发育或成年个体的生理功能很重要等。但这种论点有不妥之处,因为:
 
针对癌症靶点的新药物常常被批评或者否定,因为它可能具有潜在的毒性。比如,该靶点对维持正常胚胎发育或成年个体的生理功能很重要,而药物可能会导致胚胎不能正常发育,或破坏人体的生理功能……等。但这种论点有不妥之处,因为:
 
首先,新靶点在胚胎发育中的功能不一定代表成年个体中的情况,而且药物一般只是使靶蛋白功能失活,这与敲除该基因是不同的,因此将靶点的遗传功能用于判断化学药靶的毒性是会误导人的。其次,化学药物的剂量可以控制在一定范围,在达到治疗效果的同时避免产生毒性。最后,药物代谢存在物种差异,很多在动物模型中观察到毒性的药物,在人体内却观察不到。
 
结 语
 
未来抗癌药物的研发依赖于药物靶点的识别和验证,因此相关研究的可重复性和可靠性非常重要,应当鼓励研究者发布详细的实验细节、增进数据共享,这方面的原则和指南也已经出台(比如NIH Principles and Guidelines for Reporting Preclinical Research和The Reproducibility Project: Cancer Biology)。另外,学术期刊总是倾向于发表那些阳性结果或前后一致的论文,造成研究者有意无意地对研究结果进行挑选。然而,我们应该认识到,发表论文只是推进科研的手段,而不是目的。发表错误的或不可靠的论文既浪费了资源,也阻碍了科研进展。我们需要的是能够经得起时间检验的优秀研究。尽管高标准的设定意味着更多挑战,但只有这样,我们才能更有效地推进抗癌研究,惠及千秋。
 
本文编译自Kaelin, W. "Common pitfalls in preclinical cancer target validation". Nat Rev Cancer 17, 441-450 (2017) doi:10.1038/nrc.2017.32
 
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