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肖百龙解读诺贝尔奖:Piezo的发现故事和未解之谜

要充分信任自己的学生、博士后,给予他们充分的时间和环境去大胆尝试。
 
受访 | 肖百龙(清华大学药学院教授)
 
采访 | Idobon
 
2021年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给了美国生理学家David Julius与亚美尼亚裔美国神经科学家Ardem Patapoutian,以表彰他们发现了温度觉和触觉的受体(“for their discoveries of receptors for temperature and touch”)。神经科学领域再次受到学界和大众的高度关注。
 
其中,Ardem实验室首次鉴定了哺乳动物中感受机械力的阳离子通道Piezo家族,并发现它们在触觉、本体感知等方面的重要作用。当时,清华大学药学院教授肖百龙正在美国斯克利普斯研究所(The Scripps Research Institute)跟随Ardem Patapoutian教授从事神经科学博士后研究,见证并参与了这项伟大的科学发现。《返朴》在颁奖后的第一时间采访到肖教授,请他为我们讲述Piezo蛋白背后的科研故事和将来的探索方向。
 
返朴:您在Aderm 实验室做博后期间,见证了Piezo蛋白的发现。可以介绍一下这个发现背后的故事吗?
 
肖百龙:2007年,我到Ardem实验室做博后,那时他们正在做温度门控的离子通道,也就是温度的分子受体的鉴定发现与研究。他们已经报道了几个温度感知的分子受体,有感受凉爽的离子通道TRPM8,感知温热的TRPV3和感知冷的TRPA1。当时Ardem还是副教授,实验室充满活力,感觉很有前景,我也因此选择了加入这个实验室,做一些与温度感知相关的工作。
 
那时,随着TRP家族的发现,温度感知已经取得很多突破。但在感知领域还有个大家都很关注的、非常重要的问题还没有解决:是什么蛋白分子介导了机械力的感知?换言之,触觉系统的分子基础还是未解之谜。当时领域内许多实验室,包括David Julius 实验室,都在寻找这个蛋白分子。
 
但机械力感知的研究很困难,没有高通量的筛选方法,只能用电生理技术对单个细胞施加机械力刺激,让它产生电流,来寻找相关的分子。这个技术非常有难度,实验室还没有人专门投入到机械力敏感离子通道的筛选工作上。到了2007年下半年,Ardem实验室招收了一个博士后叫Bertrand Coste。Bertrand在法国接受了三年的博士训练,主要工作就是记录背根神经节的机械敏感电流,有非常扎实的电生理技术,和Ardem的需求非常匹配。
 
Bertrand筛选离子通道的策略是:
 
1. 先筛选细胞系,看哪些细胞系会产生机械敏感的电流。他发现N2A细胞能响应机械力,产生内向电流。
 
2. 然后利用RNA profiling技术,找到N2A细胞中高表达的膜蛋白(两次跨膜以上)编码基因,共确定了500多个候选基因。
 
3. 接着便是对这些基因逐一敲低(knock down)。这是一项高度重复的艰苦工作,最终在第72个候选基因上,找到了决定N2A细胞机械敏感电流的基因,FAM38a。后来根据希腊语,将这个蛋白命名为“Piezo”,意思是压力。
Piezo蛋白的电生理筛选过程示意。用黑色针头戳细胞膜(施加机械力刺激),在另一侧用玻璃电极记录细胞膜上的电流变化。细胞膜受力后,Piezo通道打开,阳离子流入细胞,玻璃电极即可记录到内流电流。Bertrand Coste先用这一方法找到了Piezo1,又根据序列同源比对找到了Piezo2。丨来源:https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2021/press-release/
 
Bertrand大概花了三年时间,成功找到了感受机械力的蛋白,要总结一些成功要素的话,最重要的是他的电生理训练非常扎实,实验工作非常严谨。但回头来看其实也有一定的运气成分。一方面,根据筛选策略,Piezo蛋白在N2A细胞里是高表达,而在对照组细胞C2C12细胞里应该是低表达,但实际情况并不符合设想的模式。实际情况是Piezo蛋白——我们后来知道是Piezo1——在C2C12细胞里的表达比N2A细胞中更高。另一方面,有500多个备选基因,Bertrand能在第72个就找到,实属幸运。如果目标在后面,那可能就要花五六年的时间去找,很难说能否坚持下去。
 
返朴:三年找一个蛋白,Bertrand想必压力很大。当时他是怎么应对的呢?Ardem作为导师又是什么态度呢?
 
肖百龙:Bertrand在这个课题进展过程中的确承受着很大压力。当时我的课题是鉴定一个新的温度感知受体,有了一定进展,那时候Bertrand还没鉴定出Piezo,我们就讨论可以一起合作研究这个新型的温度受体,这样万一鉴定工作不顺利,Bertrand也能有论文,对他的职业生涯有帮助。但一段时间后,Bertrand成功筛选到了Piezo1。后续的实验证实,敲低Piezo1可以使N2A细胞丧失感知机械力的能力,而且在其他对力不敏感的细胞——比如HEK293T细胞中——过表达Piezo1,能使HEK293T细胞获得机械敏感性。这就完全证实了他的发现:Piezo1基因是编码介导机械敏感阳离子电流的必要与充分组成成分。
 
这个发现出来以后,Bertrand, Ardem以及实验室成员都很兴奋,大家都意识到这是一个非常重要的突破,整个实验室也从温度受体迅速转向,投入到Piezo的研究中。
 
Ardem的实验室环境总体是非常宽松友好,大家效率也很高,压力主要来自我们自己。而Ardem则非常包容,给大家足够的信任,让大家自由探索。我从Ardem身上也学到了这一点,要充分信任自己的学生、博士后,给予他们充分的时间和环境去大胆尝试。当然,Ardem实验室主要都是经过良好学术训练的博士后,大家有足够的学术积累和技术特长去主导自己的课题。
 
返朴:Piezo蛋白和我们的健康究竟有哪些关系?
 
肖百龙:Piezo家族有两个成员,一个是Piezo1,一个是Piezo2。Piezo2直接和我们的触觉感知相关。正常人的抚摸、拥抱、使用各种工具,比如触摸手机屏幕,都需要Piezo2的参与。还有“本体觉”,就是我们自身的肌肉状态,比如走路时保持平衡,是因为神经系统中的Piezo2能监测到肌肉的整张度。另外,我们的内脏器官的机械变化,譬如血压、呼吸、膀胱充盈度等也被Piezo2所监控。
 
已有非常明确的遗传学证据表明,如果Piezo2突变或者缺失,会引发明显的触觉缺陷,病人对震动、触碰的敏感性会显著降低。另外,本体感觉能力会受到很大影响,例如,蒙住病人的眼睛,屏蔽视觉信息,病人就走不稳路,摸东西也摸不准。甚至还会导致骨骼系统变形,例如,脊柱中正是因为两侧肌肉牵拉,张力平衡,而缺失Piezo2的病人无法感受肌肉张力,两侧肌肉就会失去稳态,导致脊柱发生严重的弯曲、变形。还有,病人会因为不能感知膀胱充盈度而出现泌尿异常。
Piezo2介导了触觉的感知,在人的机械痛、排尿、呼吸、血压、骨骼重塑等生理过程中起着重要作用。来源丨https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2021/press-release/
 
Piezo1的表达就很广泛了。比如心血管系统,Piezo1在血管内皮细胞、红细胞、上皮细胞、心肌细胞上都有表达,起着很重要的作用。有一种疾病就是由Piezo1功能太强导致的,会造成红细胞变形,令其携带氧气的功能发生紊乱,造成贫血。而Piezo1缺失则会导致淋巴管水肿、胚胎流产等症状。
 
我们自己的工作发现,Piezo1在心肌细胞里表达,参与感知心脏收缩舒张所产生的剧烈机械变化,从而调控心脏稳态;心脏病患者的Piezo1表达会出现上调。我们与合作者还发现,Piezo1对骨的生成和重塑非常重要。长期卧床或在太空失重会导致严重骨质丢失,而骨骼之所以能感受到重力,是因为成骨细胞中表达了Piezo1。当我们从小鼠中敲除Piezo1,小鼠会出现严重的骨质丢失;而骨质丢失病人的体内,Piezo1表达下调了。
 
返朴:也就是说,虽然这次诺奖的发奖理由使用的“touch”这个词,媒体报道为触觉,但其实“touch”并不是简单的“手摸到了什么东西”,它其实非常广泛,甚至是每个细胞对力的感知,可以这么说吗?
 
肖百龙:对!从力学的角度来说,只要有接触就会有力的产生,因此只要有接触就会造成力的感知,这个感知很有可能就是通过Piezo通道来介导的。Piezo2主要和触觉、本体觉、内脏觉机械力感知相关,而Piezo1则在机体的很多细胞组织中都存在。有研究发现它在癌细胞里也有表达,对癌细胞的增殖与转移起着重要作用,因为癌细胞的迁移也会涉及到力的感知。从这个角度来说,Piezo通道的功能非常广泛,因而也是无比重要的。
 
返朴:您在Ardem 实验室参与了Piezo最初的重要工作,成为独立PI后,又做出了很多推动性成果,可以介绍下您和其他实验室在Piezo领域的重要成果吗?
 
肖百龙:2010年Ardem实验室在Science上报道了Piezo蛋白介导机械力感知以后,就有很多后续问题等待解决。这个基因编码的蛋白非常独特,有2500个氨基酸,预测有30~40次跨膜,是人类蛋白中跨膜次数最多的一类膜蛋白,而且与已知的其他电压门控离子通道——例如钙通道、钠通道、钾通道或温度敏感TRP通道(譬如这次获奖的另一主角TRPV1)——没有任何序列上的类似性。因此2010年的这篇文章只能下结论说Piezo是力感知器的重要组成部分,但不能确定它是直接感受机械力的成孔离子通道。毕竟还存在着另外一种可能性,Piezo蛋白可能是成孔亚基的辅助亚基,赋予机械敏感性。
 
为了解决这个问题,Bertrand和我展开了合作。我在博士期间做过兰尼碱受体(Ryanodine receptors)的生化、结构、功能研究,对大型膜蛋白有很好的研究背景。于是我第一个把Piezo1蛋白重组表达纯化出来,证明它形成多聚体,并组装在脂双层上。我们发现在没有其他任何细胞成分的人工膜环境下也能记录到阳离子电流存在,证实了Piezo1是一类全新的感受机械力的离子通道。这篇文章2012年发表在Nature上,我和Bertrand是共同一作。这就是我早期在Ardem实验室参与的工作。
 
Piezo通道这类全新机械门控离子通道家族的发现和确立带来了很多契机。一方面,需要证明它的病理、生理功能的重要性,通过在小鼠、果蝇、斑马鱼等模式动物上敲除这个基因,看看会发生什么表型改变。另一方面,这个离子通道在分子机制上是怎么工作的?换言之:Piezo通道蛋白怎么将机械力刺激转化为离子的选择性通透、转化为电信号?这是一个核心问题。
 
2013年1月,我在清华组建了自己的课题组。
 
我们知道2013年程亦凡和David Julius合作用冷冻电镜解析了TRPV1的原子分辨率的结构,而Piezo蛋白是一个非常复杂的全新蛋白,如果不了解它的结构,要去研究它的机制会非常困难。因此我决定改变研究范式,先获得结构,再做功能机制研究,这样会更加高效。基于我自己的研究背景、利用在哺乳动物细胞系HEK293T细胞里重组表达,我们拿到了纯化的Piezo1蛋白。当时恰逢清华在建立冷冻电镜平台,我们实验室最初与高宁、杨茂君合作,之后与李雪明课题组长期合作,取得了Piezo1蛋白的中等分辨率和接近原子级别的高分辨率结构(Nature 2015, Nature 2018),建立了它同源三聚体、螺旋桨状的结构,搞清楚了离子通道最核心的孔道区在什么地方,与机械力感觉相关的结构域等。
 
在我们于2015年报导了Piezo1的首个中等分辨率结构后,我们实验室(与李雪明实验室合作)、Ardem实验室和Roderick MacKinnon(2003诺贝尔化学奖得主——记者注)实验室大约在同一时间解析出了Peizo1蛋白的高分辨率结构。我们和Ardem的文章背靠背发表在Nature上,MacKinnon则发在eLife上。
 
相比Peizo1的结构研究,Peizo2的分子生化更难。我们和李雪明课题组合作,首次、唯一报道了Peizo2的完整结构,确定了它的每个亚基包含38个跨膜区的完整拓扑结构。这为我们研究Peizo2离子通道、感受机械力的分子机制提供了重要的线索。据此,我们进一步开展了大量的基于结构导向的结构功能研究,揭示了Piezo通道的离子通透、机械门控的分子机制。
Piezo2的蛋白结构图。丨供图:肖百龙
 
除了分子机制方面的研究,还有药物工具分子的筛选发现。由于Piezo是全新的离子通道家族,因此与温度敏感离子通道TRPV1以及其他电压门控离子通道相比起来,它的药物工具非常匮乏。Ardem通过高质量的筛选,筛选到了一个小分子Yoda1;我们在清华也做了自己的筛选,筛选出两个药物小分子Jedi1/2,能够激活Piezo1,我们也进一步研究了这些小分子药物的激活机制。
 
目前看来,在生理病理功能方面,Ardem实验室做了大量重要的发现,而在分子机制方面我们实验室做出了重要的贡献。
 
返朴:大家对Piezo家族已经取得很多认识,下一步重要的待解决问题是什么?还有哪些重要的工作要做?
 
肖百龙:我认为有三个方面。第一,Piezo通道怎么把机械力转成电信号,这个核心问题还没有完全解决。现在已经有一些进展,但还处于假说阶段,还需要更多结构功能方面的研究。例如,我们现在拿到的还只是Piezo通道在关闭状态的结构,那它到底是怎样在受力以后变成开放状态的呢?这中间的动态的过程是怎样的?其实,包括TRPV1,到底是怎么感知温度引起通道开放的,现在也还是没有解决的问题。而TRPV1从1997发现到现在已有20多年了,这个核心问题一直还没有解决。
 
第二,Piezo通道现在已经被报道具有非常广泛的生理病理功能。但是绝大多数的工作都是在敲除体系下的表型描述,具体Piezo到底是怎样利用它的机械敏感性、离子信号,来调控相关的生理病理功能,都还有待更深入的研究。
 
第三,针对Piezo通道的药物发现与开发。现在已经明确Piezo2和触摸超敏痛密切相关,且Piezo2的表达集中在外周感觉神经元,那么针对Piezo2的药物设计有着非常大的前景。但是由于Piezo通道分子生化研究的困难性,药物研发方面还有待突破,这也是我们实验室的一个长期研究目标。



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