第一位在这方面取得突破的，当属现代生物化学的先驱，德国人费歇尔（E. Fischer，1902年诺贝尔化学奖获得者）。他将酪蛋白、蚕丝纤维、明胶等蛋白质置于浓盐酸中长时间煮沸，从水解产物中分离鉴定出13种氨基酸。更为重要的是，费歇尔证实氨基酸之间可以通过氨基（–NH₂）与羧基（–CO₂H）缩合形成酰胺键的方式相互连接，他把这种氨基酸的缩聚物称为“肽”^‡。1901至1906年间，费歇尔合成了百余种多肽，其中最复杂的由15个甘氨酸和3个亮氨酸缩合而成。尽管费歇尔的合成条件十分苛刻，所得产物中氨基酸残基的手性构型难以保持，但是人工多肽所表现出的与天然蛋白质相似的化学性质和水解行为，足以使20世纪初的化学家意识到，氨基酸—多肽—蛋白质，形成了一种逐次递进的分子结构层级。

若将氨基酸残基比作错落的明珠、酰胺键构筑的长链好似贯珠的丝线，构成蛋白质的多肽就如同一条多彩的珠串。一个显见的问题是，氨基酸残基在多肽链中的排列是否有规律可循？曾是费歇尔学生和助手的伯格曼（M. Bergmann）和美国生物化学家尼曼（C. G. Niemann）于1937年提出一项假说，认为氨基酸残基如同循环小数一般，按照确定的次序在天然肽链中重复出现。这项假说的批评者甚多，有人主张氨基酸残基在肽链中随机分布，甚至同种蛋白质的氨基酸序列也未必完全一致。更有深受胶体化学思想影响的学者并不相信长肽链的存在。在他们看来，蛋白质不过是许多短肽通过分子间非共价作用聚集在一起的混合物。这些莫衷一是的意见，在英国剑桥大学的生物化学家桑格（F. Sanger）于1955年发表牛胰岛素的完整氨基酸序列后，被彻底否定。关于蛋白质一维结构模式的问题也随之得到一锤定音的解答。

图1. F. Sanger（1918~2013），1958年、1980年诺贝尔化学奖获得者 | NIH

桑格完成的牛胰岛素测序工作历时12年。但这并不是一项从一开始就有明确目标和规划的“有组织科研”，而更像一场摸着石头过河、根据现实条件不断调整航向的谨慎探险。1943年，桑格在剑桥大学获得博士学位，作为博士后加入同校蛋白质化学家奇布纳尔（A. C. Chibnall）的实验室。后者建议他研究蛋白质N端的氨基酸。当时高纯度的胰岛素可以直接从药店购买，因而成为这项研究唯一可用的原料（事实证明也是最合适的原料）。桑格找到了一种名为1-氟-2,4-二硝基苯的试剂（简写为FDNB，现在通称“桑格试剂”），能在温和条件下与多肽链N端氨基酸的自由氨基反应，生成稳定的DNP标记物。标记后的肽链再经浓盐酸完全水解，所得混合物中仅有原N端氨基酸带有DNP标记。这种标记的氨基酸呈明亮的黄色，可通过配分色谱或者纸层析分离鉴定出来。桑格用这种方法处理胰岛素，得到等量的带有DNP标记的甘氨酸和苯丙氨酸。这意味着胰岛素含有两种多肽链，分别被称为A链（N端为甘氨酸）和B链（N端为苯丙氨酸）。

图2. 桑格试剂测定多肽N端氨基酸的原理

桑格通过调整盐酸的浓度、反应温度和时长，摸索出一系列能把多肽链部分水解的条件。胰岛素B链可以被水解为几十种序列部分重叠的小肽段，每条肽段含2至6个氨基酸残基。根据其溶解度和酸碱性的差异，桑格采用离子电泳、离子交换色谱和纸层析等手段将所有小肽段分离开。对于每个小肽段，一方面通过浓盐酸完全水解，得知其所有氨基酸组成，另一方面使用FDNB标记的方法测出其N端氨基酸的种类。以小肽段之间重叠的部分为线索，逐步解析出胰岛素B链中五个局部的氨基酸序列。例如，下表列出了几种含半胱氨酸的小肽段。根据它们N端氨基酸的种类（蓝色）和剩余的氨基酸组成（红色），可以推断出此局部的序列：亮氨酸·缬氨酸·半胱氨酸·甘氨酸。

这些局部的氨基酸序列并不完整，为了弥补它们之间的缺口，桑格需要获取更长的肽段。他发现使用蛋白酶水解胰岛素能解决此问题。与盐酸水解反应相比，酶解反应选择性极高，仅在少数特定位点切断B链，从而得到一些长度为8至22个氨基酸残基的长肽段。对这些肽段进行测序，发现其中有三个恰好缝合了此前五处局部序列之间的缝隙！1951年，桑格与合作者在英国《生物化学期刊》上连续发表了两篇论文，报道了胰岛素B链全部30个氨基酸的序列。
 

图3.（左）桑格的胰岛素测序实验中产生的纸层析图谱。（右上）桑格的实验记录，两处蓝色方框内的文字分别是“结果毫无用处，想来一定是把斑点搞混了（results useless and crazy … think must have got spots muddled）”和“不确切（inconclusive）”。（右下）桑格记录的胰岛素序列（1953年12月，当时二硫键的结构还未完全确定）。

胰岛素的A链比B链短些，但是测序难度更高。这是因为A链的水解过程会产生一批水溶性较强的肽段（含半胱氨酸磺酸基团），使其分离纯化极具挑战性；且有多个氨基酸重复出现（如半胱氨酸多达4次），仅出现一次、可用于定位的特征性残基较少，给确定小肽段的位置造成很多困难。尽管如此，桑格与合作者攻克了这些难题，于1953年发表了胰岛素A链全部21个氨基酸的序列。胰岛素测序的最后一关是确定“二硫键”的形成方式。二硫键由两个半胱氨酸的巯基（–SH）二聚而成，它既能在两条多肽链之间建立连接，又能在一条多肽链中造出环状结构。胰岛素中有6个半胱氨酸残基，理论上存在多种形成二硫键的可能。桑格与合作者发展出一种在不破坏二硫键的前提下部分水解胰岛素的方法，产生“工”字型（对应链间二硫键）和环形（对应链内二硫键）的小肽段。通过测定这些肽段的序列，并与已知的A/B链序列对比，桑格等人在1955年确定了胰岛素中两个链间二硫键和A链的一个内部二硫键所处的位置。

胰岛素的测序是现代生物化学史上的一大壮举。桑格的工作不但绘制出胰岛素的结构地图，而且终结了化学家关于蛋白质一维序列的长期疑虑。天然多肽链中的氨基酸残基既没有严格的循环结构、也不是无序的随机排布。每种蛋白质都对应着唯一、确定的氨基酸序列！1958年，桑格因为解析胰岛素序列的工作被授予诺贝尔化学奖。桑格的成功当然离不开FDNB标记法的强大和他本人的长期努力，其实也和胰岛素这个绝佳的实验样品密不可分。现在我们知道，胰岛素单体总共仅有两条多肽链，51个氨基酸和三个二硫键。作为最简单的蛋白质之一，胰岛素为桑格的实验技艺提供了恰如其分的舞台。他的方法极端依赖对蛋白质水解和肽段分离条件的精准掌控，以及在拼接肽段时的逻辑推理，从某种意义上说并不具备普适性。1950年，瑞典生物化学家埃德曼（P. V. Edman）发明了以他的名字命名的多肽降解法。用异硫氰酸苯酯（PITC）特异性标记多肽链N端的自由氨基，并在极温和条件下将N端的首个氨基酸（的衍生物）从多肽链上切割下来。这种“保链”水解使得蛋白质测序能够以一种程序化的方式进行。1967年，基于埃德曼法的蛋白质测序仪被发明出来，能够自动化测定肽链N端50至60个氨基酸残基的序列，极大推动了现代生物化学的发展。如今的蛋白质测序主要依靠高通量串联质谱技术，埃德曼法仍然是某些特殊场景下的金标准，而桑格的测序故事已被收藏于历史的陈列室。

1918年，桑格出生于英格兰南部的一个富裕家庭，他的母亲是一位棉花富商的女儿。桑格继承的巨额遗产支持了他早期的研究。经济上的宽裕和对科学的纯粹热爱，使得桑格能够长时间沉浸于一线的实验工作。桑格的整个学术生涯都在剑桥大学度过，但他始终不是该校的教授。他的正式身份是英国医学研究理事会（MRC）的研究员，既没有发表论文的压力，也不用为琐碎的行政和教学事务分心。1960年代，桑格开始涉足核酸测序领域。1977年，桑格等人实现了ΦX174（一种微小的单链DNA噬菌体）的全基因组测序，发明了著名的“双脱氧链终止法”。1980年，桑格由于在DNA测序方面的贡献再次被授予诺贝尔化学奖。他是历史上第一位两度获此殊荣的人。

图4. D. C. Hodgkin（1910~1994），1964年诺贝尔化学奖获得者 | Nobel Foundation archive

早在桑格开始研究胰岛素序列的九年前，有一位初出茅庐的女科学家，在距离剑桥两小时车程的牛津大学，一间由地下室改建的实验室里，同样思索着胰岛素的问题。她的名字叫多萝西·克劳福特（D. Crowfoot^§）。多萝西的目标更加宏伟：“看见”胰岛素的三维结构，即分子中所有原子在空间中的相对位置。她所凭借的手段是X射线晶体衍射。X射线是一种波长极短的电磁波。当它以一定的角度照射晶体时，被其中有序排列的原子（准确地说是原子核周围的电子云）散射。若原子间距和X射线波长满足一定条件，散射波会发生相长干涉，进而形成特征性的衍射斑点。通过解析这些斑点的位置和亮度，可以反推出晶体内部的电子密度分布，从而确定分子中各原子的种类和位置关系。目前，X射线晶体衍射是化学家研究分子结构最直观的方法。使用常规的四圆衍射仪与成熟的结构解析和精修程序，依靠高质量的晶体确证有机小分子的结构并非难事。如果采用同步辐射光源产生的高亮度、高分辨率的X射线，晶体衍射的应用范围还可以拓展至复杂的生物大分子。然而这一切便利条件在1930年代并不具备。彼时，记录衍射斑点的照相设备全靠“手搓”，解析结构所需的繁琐数学全凭手算。更加困难的是，X射线晶体衍射在复杂分子结构解析方面的潜能尚未被化学界认可，使得多萝西很难争取到充足的经费与设备支持。

1934年，尚未取得博士学位的多萝西（她于1937年获得剑桥大学的博士学位）在导师贝尔纳（J. D. Bernal）的帮助下谋得牛津大学的一个临时教职。尽管实验条件简陋，多萝西依然把研究目标定为具有重要生理意义但是结构未知的有机分子。胰岛素显然是一个理想的候选者。在糖尿病临床治疗巨大市场的牵引下，胰岛素的提取和纯化工艺被不断优化。1926年，美国药理学家阿贝尔（J. J. Abel）首次报道了胰岛素结晶的制备方法。但是，衍射实验需要将晶体长时间暴露在X射线的照射下，对晶体的尺寸和稳定性都有较高的要求。多萝西对胰岛素结晶的条件进行了进一步探索，终于在1935年春取得突破。多年以后，多萝西仍能清晰地回忆，冲洗出胰岛素晶体衍射斑点照片的那个深夜，是她人生中最激动的时刻。她无法入睡，独自在牛津的街道徘徊，直到被巡逻的警察劝回学校。

然而，胰岛素结构的复杂程度远远超过1930年代晶体学家的能力范围。多萝西暂时把它放在一旁，把目标转向简单些的分子。青霉素在二战中拯救了无数生命，其分子结构却长期存在争议。1945年，多萝西利用X射线晶体衍射将其成功解析，证明其中含有一种极为罕见的β-内酰胺并噻唑烷环系，这才为有机化学家们的争论画上了句号。此项成果让多萝西声名鹊起，她紧接着完成了胆固醇和维生素B₁₂等复杂分子的结构解析。1964年，多萝西由于利用X射线技术研究重要生化物质的结构获得诺贝尔化学奖。她是继玛丽·居里（Marie Curie）和伊雷娜·约里奥-居里（I. Joliot-Curie）这对母女之后，第三位获得诺贝尔化学奖的女性，也是第一位来自英国的女性诺贝尔奖获得者（当时英国媒体用略带戏谑的语气称多萝西为“牛津主妇”）。在诺奖演说的结尾，多萝西提到了胰岛素，这个让她魂牵梦萦的分子。经过漫长的等待和酝酿，解决这一挑战的条件已经成熟。

图5.（上左）阿贝尔拍摄的胰岛素结晶的照片。（上右）胰岛素晶体的X射线衍射斑点。（下左）胰岛素六聚体沿其三重对称轴方向的结构投影图。（下右）简化显示胰岛素六聚体结构的“飘带图”，中心的紫色小球表示锌离子（PDB编号：2A3G）。部分图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1926, 12, 132. Recent. Prog. Horm. Res.1971, 27, 1.

解析胰岛素结构的核心困难，是所谓的“相位”问题。根据X射线晶体衍射的基本原理，晶体中的电子密度分布ρ(r)由晶胞内所有衍射结构因子F关于倒格矢h（即衍射指标）的三维逆傅里叶变换给出

其中r是晶胞内的位置矢量，V是晶胞体积，结构因子，其振幅|F_h|可由衍射斑点的亮度推算，但是相位信息α_h无法从实验结果还原。对于简单的有机小分子，可以基于某种猜测的相位试算电子密度与分子结构，并反复迭代直至自洽收敛。但是，胰岛素晶胞中原子数目极多（菱面体晶系的单胞内包含6个胰岛素单体，其三重对称轴上有2个锌离子），理论上能产生6万多个衍射点，普通试错法难以胜任。1950年代，佩鲁兹（M. Perutz）首先将同晶置换法应用于蛋白质的晶体结构解析，为解决相位问题提供了方案（他与J. C. Kendrew分享了1962年诺贝尔化学奖）。具体到胰岛素晶体，需要分别制备多种重原子衍生物：有些可由铀酰或有机汞试剂直接浸泡晶体获得；另一些则需要先使用有机螯合剂去除原晶体中的锌离子后，再引入铅离子。整个过程需要严格控制温度、浓度和pH值，确保重原子置换前后晶胞参数、空间群和分子排列不变。在获得一系列含不同重原子的胰岛素晶体后，根据其衍射强度求解帕特森（A. L. Patterson）函数，可直接得到与胰岛素结合的重原子的坐标。将其带入同晶置换方程，可知重原子对结构因子的贡献，进而推算出胰岛素晶体的初始相位。在理论困难被破解的同时，硬件进步也给予多萝西极大的助力。当时，她的团队已经开始使用商品化的四圆单晶衍射仪收集数据，并利用牛津大学计算实验室的资源进行结构因子和逆傅里叶变换的计算。更为重要的是，多萝西手中有桑格测定的胰岛素一维序列。这好似一份藏宝图，让她在从电子密度分布还原三维分子结构的过程中成竹在胸。1969年，一篇题为《菱面体二锌胰岛素晶体的结构》的论文在《自然》杂志发表，这篇论文有10位共同作者，文章的末尾还致谢了曾参与这项工作的其他23人。但是，所有人都明白，胰岛素分子三维结构的解析是多萝西35年滴水穿石般不懈努力的结晶。

在牛津大学，多萝西不仅是出类拔萃的科学家，更是打破性别壁垒，为女性争取接受高等教育和从事科学研究机会的开拓者和守护者。她的课堂和实验室吸引了众多女学生，其中有一位名叫玛格丽特·罗伯茨，多年以后成长为叱咤英国政坛的“铁娘子”——撒切尔夫人（Margaret Thatcher）。尽管政治立场迥异，她们始终保持着良好的私人关系。在撒切尔夫人主政英国的11年间，唐宁街10号的首相官邸内一直悬挂着多萝西的画像，以示她对老师的敬意。多萝西受导师和丈夫的影响，是一位思想左倾的共产主义理想的同情者，对第三世界国家怀有深厚的感情。1959年，多萝西随英国友好代表团到访北京，出席了庆祝中华人民共和国成立十周年的典礼。此后多萝西7次访华，与唐有祺、梁栋材等中国晶体学家有深入的交往，推动了蛋白质晶体学在中国的发展。

1972年，正值胰岛素发现50周年，多萝西受邀在美国糖尿病学会作班廷纪念讲座。面对主要由医生和生理学家组成的听众，她提到巴伦的论文激励班廷的故事。在报告结尾，多萝西说胰岛素结构测定的过程十分枯燥，但她愿意相信这些枯燥的事实会激励另一位班廷走上他的道路（I should like tothink that there may be something in the facts Idescribe to start another Banting on his way）。

†关于贝采利乌斯和“电化学二元论”的故事，参见拙作《一场国际化学会议上散发的小册子，拨开了分子学说的迷雾》。

‡肽的英文peptide来源于希腊语πέψις，意为“消化”，指肽是蛋白质部分分解的产物。

^§多萝西1937年与历史学家托马斯·霍奇金（T. L. Hodgkin）结婚并冠夫姓。为保持叙述连贯，本文始终称她为“多萝西”。

[1] F. Sanger, The chemistry of insulin. Nobel Lecture, 1958.

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[15] Jie Jack Li（美）著，邓卫平、游书力译，《药物考——发明之道》，华东理工大学出版社，2007年。

[16]【英】乔治娜·费里著，王艳红、杜磊译，《为世界而生：霍奇金传》，世纪出版集团、上海科技教育出版社，2010年。

[17]【美】萨利·史密斯·休斯著，孙焕君译，马红武审译，《基因泰克：生物技术王国的匠心传奇》，中国人民大学出版社，2017年。

[18] 熊卫民，王克迪著，《合成一个蛋白质——结晶牛胰岛素的人工合成》，山东教育出版社，2005年。

[19] 杜严勇著，《胰岛素探秘者——张友尚传》，上海交通大学出版社、中国科学技术出版社，2015年。