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胰岛素百年路:小小蛋白,四届诺奖|世界糖尿病日

撰文 | 望羲

昨天(11月14日)是第15个联合国糖尿病日,又恰逢胰岛素发现100周年。而在历史上,与胰岛素有关的研究竟然神奇地四获诺贝尔奖。今天,就让咱们来盘点一下这四个诺奖吧。

 

联合国糖尿病日logo丨图片来源:联合国官网

奖金一分为二,二分为四

联合国糖尿病日之所以选定在11月14日,是为了纪念胰岛素的发现者弗雷德里克·班廷(Frederick Banting)——这一天是他的诞辰。

 

班廷丨图片来源:wiki

话说1919年,参加完一战的班廷退役了,并在迷茫中修完了多伦多大学的医学学位。由于没找到工作,他干脆回老家开诊所。传说这家诊所在开业20多天后才迎来第一位病患/顾客,生意自然是做不下去了,班廷就跑到当地的西安大略大学谋了个兼职教师的工作,主要是讲点解剖学和生理学。

1920年10月,学校给他安排了关于糖代谢的课。班廷原本是门外汉,为了养家糊口,也只能硬着头皮上。他找来大量文献备课,发现糖尿病与胰脏的关系很早就被证实了,而且怀疑跟胰岛有关。但由于胰岛的分泌物很少,并且很容易分解,因此还没有人成功分离过。碰巧的是,当时的一篇期刊上正好介绍了胰腺结石。在病例中,患者的结石阻塞了胰管,回流的胰液导致胰腺萎缩,可胰岛却留存完好,并且也没有引发糖尿病。

班廷来了灵感:这个病例一方面说明胰岛中有能防止糖尿病发生的物质,另一方面,如果按照同样的思路,把动物的胰管结扎让胰脏萎缩,剩下的部分里,应该就能提取出可以降血糖的这种物质。他把这些想法记在了1920年10月31日的笔记上。

紧接着,班廷跑到多伦多大学游说当时的糖代谢专家麦克劳德(John Macleod)。麦克劳德大概是觉得人和动物的降糖物质不可能一样,要么就是觉得眼前这个连工作都差点找不到的人,不存在任何概率获得前人分离不到的物质,所以他起初不为所动。

麦克劳德丨图片来源:wiki

但班廷没有放弃,他不辞往返几百公里的辛劳,有空就跑到多伦多忽悠麦克劳德。到1921年暑假,麦克劳德似乎被班廷说服了,他觉得即使搞不出什么真东西,至少可以发篇论文。于是在回苏格兰老家度假前,麦克劳德把实验室钥匙留给了班廷,一起留下的还有十条狗和学生查尔斯·贝斯特(Charles Best)——这么并列有点怪……

不知道是不是对自己的手艺过于自信,等来机会的班廷一把就将十条狗的胰管全部结扎。不幸的是,这批狗狗很快就都死了。

考虑到必须高效利用麦克劳德休假的空窗期,班廷卖掉了自己的诊所,换来钱不断买狗狗做实验。他的坚决感动了贝斯特,为了省钱,贝斯特不计报酬地跟班廷对狗进行外科手术。他们把狗狗萎缩的胰脏切片,并在冷冻状态下研磨,然后加入生理盐水提取,再将提取液注射到被摘除了胰脏的糖尿病狗狗体内。经过多次实验,提取液起作用了:注射后,狗狗的血糖下降;停止注射,血糖升高。 

班廷(右)、贝斯特(左)和实验犬丨图片来源:科学网

麦克劳德闻讯结束休假,回到实验室了解情况。在知晓班廷和贝斯特的全套实验后,他意识到,降糖的物质,搞不好还真的人狗同源,甚至哺乳动物都同源。作为老谋深算经验丰富的专家,他提出了三条建议:

第一,从屠宰场弄牛胰腺来做提取——不杀狗,省钱;

第二,把提取物注射进健康的兔子体内,如果兔子低血糖,那就能证明有效——不杀狗,省钱;

第三,把化学家詹姆斯·克里普(James Collip)拉入团队,帮助提纯胰岛素。 

詹姆斯·克里普丨图片来源:wiki

麦克劳德的合理化建议让项目进展神速,到年底,团队提取胰岛素的纯度和速度都极大提高,够得上做出来给人用了。

1922年1月11日,一位14岁的加拿大少年在人类历史上第一个接受了胰岛素治疗。原本只有几个月预期寿命的他,后来活到了27岁。当然,不是胰岛素不给力,而是这个年轻人死于车祸。同年,美国时任国务卿休斯的女儿伊丽莎白·休斯也接受了胰岛素治疗。在治疗前,15岁的小女孩体重只有20公斤,治疗后她恢复了健康,最终活到了75岁,并育有三个子女。

临床上取得成功的胰岛素,让班廷名声大噪。第二年,32岁的他就跟麦克劳德一起分享了1923年的诺贝尔生理学或医学奖,此时距他开始胰岛素的研究仅仅两年。班廷不仅是诺奖历史上最快获奖之一,还保持着生理学或医学奖的最年轻得主纪录。美中不足的是,两位得主略有龃龉。

班廷认为麦克劳德一开始不认可自己的想法,不应该获奖,倒是一直跟自己做实验的贝斯特应该得奖。拿到奖金后,他给贝斯特分了一半。麦克劳德也“投桃报李”,拿出自己奖金的一半,给了帮助提纯胰岛素的克里普。

 

取下项链上的珍珠

神仙打架的事情,咱们凡人说不清,继续说回胰岛素。

最开始的胰岛素药品,是从动物中提取制成的,但它在临床应用上难免有问题。比如容易触发人体免疫反应,产生抗体后降低疗效不说,在部分患者身上甚至还会产生副作用。最主要的,这种提取得来的胰岛素,产量太低、药价太高,无法满足大众对胰岛素的需求。但由于当时还没有人弄清胰岛素的结构,自然无法通过人工合成来批量生产。

想弄清结构,得有纯的胰岛素,可当时市售的胰岛素药品,纯度只有10%左右,差得有点远。

最早得到胰岛素晶体的人,是美国化学家艾贝尔(John Jacob Abel)。 

 

艾贝尔丨图片来源:wiki

1925年,他使用镀锌容器引入关键的锌离子,幸运地得到了胰岛素的晶体,却又不幸地认为得到的结晶只是小分子“抑糖激素”的载体。

1926年3月之后,也许是换了容器,艾贝尔再也没有得到胰岛素晶体,他只能放弃对胰岛素本质的思考。几年后,胰岛素结晶化中锌的秘密被揭开,对其结构的探索才重新推进。

胰岛素晶体丨图片来源:wiki

既然胰岛素是蛋白,那么到底是哪些氨基酸,按照什么顺序组成胰岛素呢?来自剑桥的青年教师桑格(Frederick Sanger)为世人揭开了这个谜团。

桑格丨图片来源:wiki

1943年,刚拿到博士学位的桑格,面临的问题是在20种氨基酸的排列组合中,找到属于胰岛素的那种组合。这听上去像是玩拼图游戏,可如果是在2020这种数以亿计的组合中,寻找正确的那一块拼图的话,简直无异于大海捞针。

在导师的建议下,桑格决定从鉴定胰岛素的氨基入手。他设想,如果能找到一种标记物紧紧结合在氨基上,鉴定氨基就容易很多。最后,他找到了2,4-二硝基氟苯,也就是桑格试剂,缩写为DNFB。

2,4-二硝基氟苯丨图片来源:作者提供

DNFB与氨基酸紧密结合显出黄色,不同的结合产物,在纸层析上会停留在不同位置,仅比较位置,就能确定DNFB结合的是哪个氨基酸。更重要的,这种结合产物不易被水解。这样,从一段蛋白的N端开始,桑格可以用DNFB把氨基酸一个个摘下来,就像从珍珠项链上逐颗拿下珍珠。

1945年,桑格先让DNFB与胰岛素反应,再用盐酸完全水解,发现两种氨基酸被标记,这说明胰岛素由两条肽组成。1951年,胰岛素B链上30个氨基酸的序列得到确定。1953年,胰岛素A链上21个氨基酸的序列得到确定。又用了三年时间,桑格解决了水解过程中二硫键的交换等问题,完成了二硫键位置的确定1954年,胰岛素的一级结构终于完全解析。 

胰岛素的天然结构丨图片来源:参考文献8

这是第一个被解析出结构的蛋白,桑格也成为世界上第一个解析蛋白质中氨基酸序列的人。

1958年,桑格独享了诺贝尔化学奖,获奖理由毫无悬念:

因为他在蛋白质结构方面的工作,尤其是胰岛素的结构。

for his work on the structure of proteins, especially that of insulin.

值得一提的是,桑格还因为独立发展出DNA测序方法,而分享了1980年的诺贝尔化学奖。

 

看清蛋白的模样

胰岛素的氨基酸序列有了,接下来的问题是,胰岛素是什么“形状”的? 

1934年,还在读博的多萝西·霍奇金(Dorothy Hodgkin)得到了一块胰岛素晶体,这在当时可是稀罕玩意儿。尽管此时的多萝西还要等三年才能拿到博士学位,但她已是X射线衍射技术鉴定分子结构方面的专家。可惜早期的仪器分辨率太低,她拍出的第一张胰岛素晶体照片无法确定分子的精细结构。 

多萝西·霍奇金丨图片来源:wiki

多萝西只能先把X射线衍射技术的强大威力“发泄”在其他生物分子上。1945年,她解出类固醇青霉素的结构。

作为人类药物史上鼎鼎大名的抗生素,青霉素的结构在很长时间内存在争议,不少科学家都提出了自认为合理的结构。大浪淘沙后,仅剩下噻唑-唑酮结构、β-内酰胺结构和三环结构经受住了考验。多萝西的研究证明了β-内酰胺结构的正确性,但为了稳妥起见,这项研究在1949年才发表。

1955年,多萝西利用X射线衍射解析出维生素B12的结构。在多萝西之前,人类还没有任何手段来确定如此巨大的分子的结构。

1964年,多萝西因“用X射线技术确定重要生化物质的结构”而独享诺贝尔化学奖。 

故事还没结束。

不忘初心的多萝西在获得诺奖五年后,最终破译了胰岛素的结构——由三个二聚体组成的六聚体

胰岛素六聚体结构丨图片来源:wiki

此时距离她拍下第一张胰岛素晶体照片已经过去了35年。

 

从分子走向临床,揭秘糖尿病

对胰岛素分子的研究在推进,对胰岛素临床使用的研究也有进展。随着疗法的推广,不少医生发现,对很多糖尿病患来说,仅仅是简单使用胰岛素还不够。糖尿病可能远比人们认为的要复杂。

很早之前,就有人注意到糖尿病人之间存在的巨大差异。有些年轻患者,身体瘦弱,即使对饮食进行低糖控制,也很难存活。而那些中年后才确诊为糖尿病的患者,通常身形肥胖,经过良好的饮食控制,生存率会明显提高。

胰岛素疗法普及后,医生们又惊奇地发现,相比于中年糖尿病患者,年轻患者需要更少的胰岛素剂量就能起到控制血糖的作用。这些现象说明,糖尿病从原理上讲并不单一,至少可以分为胰岛素敏感型和非敏感型

20世纪50年代,美国物理学家雅洛(Rosalyn Yalow)开发出放射性免疫分析法(radioimmunoassay,RIA),确定了胰岛素与II型糖尿病之间的关系。

雅洛丨图片来源:参考文献6

雅洛检测了两类糖尿病病人的血液胰岛素含量,结果发现胰岛素非敏感型病人的血液中含有胰岛素,并不是之前认为的胰岛素缺陷。这项工作不仅开发出多肽类激素的检测方法,也直接促进了人类对于糖尿病的病理学认识。

糖尿病主要分为两大类:I型糖尿病通常在儿童时期发病,是一种自身免疫性疾病,患者胰腺分泌的胰岛素很少或根本不产生胰岛素;II型糖尿病患者的身体不能很好地利用胰岛素,无法将血糖维持在正常水平。I型糖尿病约占病例的10%,II型糖尿病约占病例的85%-90%,而在II型糖尿病中,除胰岛素分泌受损之外,肥胖是最主要的诱因。

1977年,雅洛获得诺贝尔生理学或医学奖。据说,她研究胰岛素的动力,除开学术上的考虑之外,还因为她的丈夫也是一名糖尿病患者。

 

结语

根据国际糖尿病联盟发布的全球糖尿病地图,目前全球成年(20-79岁)糖尿病患者约为5.37亿,预计到2030年将达到6.43亿;每年因糖尿病死亡的人数为670万,平均每5秒钟就有一人因糖尿病而死去,这让我们不得不加强对糖尿病的关注。

全球糖尿病地图丨图片来源:参考文献10

从班廷发现胰岛素至今已历百年,治疗糖尿病的新药陆续被研发,但说到底,控制好体重,保持健康的生活方式,才是远离糖尿病的王道。 
 

参考文献

[1]维基百科相关词条

[2]Insulin: Discovery and Controversy. Clinical Chemistry. 48 (12): 2270–2288

[3]Frederick Grant Banting (1891–1941) Codiscoverer of Insulin. Journal of the American Medical Association. 198 (6): 660–61. 1966

[4]Frederick Sanger (1918–2013) Double Nobel-prizewinning genomics pioneer. Nature. 505 (7481): 27.

[5]Nobel lecture: The chemistry of insulin (PDF), Nobelprize.org

[6]In Memoriam: Dr. Rosalyn Yalow, PhD., 1921–2011. Molecular Endocrinology. 26 (5): 713–714.

[7]Dorothy Crowfoot Hodgkin (1910–1994). Protein Science. 3 (12): 2465–69.

[8]100 years of insulin: celebrating the past, present and future of diabetes therapy. Nature Medicine. 27: 1154–1164(2021).

[9]Celebrating 100 years of insulin. Diabetologia. (2021) 64:944–946.

[10]https://diabetesatlas.org/

本文经授权转载自微信公众号“科学大院”,原标题为《一种蛋白,四个诺奖,两位女性》。

 



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