撰文 | 李庆超（山东师范大学）

病毒是导致人类疾病的一类重要病原体。早在还不知道什么是病毒的时候，人类就已经想方设法对付病毒了。中国人明朝就开始使用人痘预防天花，1798年，英国医生詹纳发明了使用牛痘作为疫苗预防天花的方法。

1885年，法国科学家巴斯德发明了狂犬病疫苗。

1892年人类发现了第一种病毒——烟草花叶病毒，这种病毒比细菌小，能让植物生病。

1898年发现了首个动物病毒——感染牛羊的口蹄疫病毒。

1901年发现了首个人类病毒——通过蚊子传播的黄热病病毒。

1911年发现了可以导致鸡肿瘤的劳氏肉瘤病毒（图1）。

图1. 病毒学发展的一些重要节点（来源：wikipedia等）

后来，人们对病毒的认识越来越深刻，病毒研究成为一门单独的学科：病毒学（图2）。和一般人想象的不同，病毒学研究除了回答基础的科学问题、预防和治疗病毒病之外，还涉及开发和利用病毒。而这三种功能都离不开最重要的病毒研究工具：反向遗传操作系统。这一系统，可以说是病毒学家的“毒门秘籍”了。

病毒学研究的第一步是病毒检测。

已知病毒的检测，主要应用于医学诊断和流行病学调查，采用的检测方法主要有症状诊断、免疫学检测、核酸检测以及一些凝血实验等特异性反应的检测。

对于未知病毒，则需要通过分离、培养、鉴定的过程去发现，最后可以通过电子显微镜来直接观察病毒。但最终要通过测序的手段拿到病毒的基因组序列。这是因为，病毒的基因组序列是其最核心的组分，抓住了病毒的基因组序列，就等于找到了病毒。

今天的科技迅猛发展，科研人员采用深度测序技术（图3），很容易就能发现大量新的病毒。对于疑似感染未知病原体的病人，我们可以在恰当的部位采样，提取核酸，构建文库，并进行深度测序。测序之后，通过生物信息的方法寻找其中的病原体序列，并给出鉴定结果。

图3. 深度测序检测新病毒，https://www.mgitech.cn/news/caseinfo/12/

找到病毒之后接下来怎么开展研究呢？接下来，我们就来介绍病毒学家所使用的最重要的研究工具：反向遗传操作系统。

遗传学及反向遗传学

为了了解反向遗传学，需要先了解一下遗传学。观察生物体，我们可以发现一些结构、功能方面的特征，比方说头发、皮肤、瞳孔的颜色，这些称之为表现型，也叫表型。表现型是由生物体的基因组所决定的，而生物个体的全部基因组合就总称为基因型（图4）。基因型决定了表型，而表型反映了基因型。

一开始，人们并不知道遗传的本质，因此最初是从表型出发来研究遗传学的相关问题的。孟德尔使用豌豆、摩尔根使用果蝇来研究遗传学，他们通过豌豆的红花、白花或者说果蝇的红眼、白眼这种表型来寻找遗传规律，并定位表型相关的基因。因此，经典的遗传学是从表型出发来研究基因型的，这就是正向遗传学。

图4. 表现型及基因型

在正向遗传学中，需要通过自然突变或诱变的方式，筛选具有特殊表型的突变体，然后再定位是哪个基因决定了这个表型，并且研究该基因的功能。

在反向遗传学中，科学家拿到一个未知的基因，可以主动对这个基因进行突变或者改变它的表达量（过表达、低表达或敲除不表达），再去观察基因突变或基因表达量的变化引起了什么样的表型变化，并与野生型（没有经过人为改变的正常基因型）的表型进行比较，从而推测基因的功能。因此，反向遗传学是通过改变基因型，观察表型改变的结果，来研究基因的功能（图5）。

图5. 正向遗传学及反向遗传学

反向遗传学的必备条件是基因工程技术

根据概念，我们不难看出，反向遗传学中，需要对特定的核酸序列进行改造，而这种改造的技术，实际上是我们认识了DNA这种遗传物质的结构和功能，发展了多种基因工程工具酶或者基因工程手段之后，才得以实现的。基因工程是利用生物技术对生物体基因进行直接操纵的、改变细胞的遗传组成的技术。因此反向遗传学的思路，要比经典遗传学的思路出现得晚。

DNA是细胞生物的遗传物质，它比RNA要稳定，而且大多数基因工程的工具酶作用对象是DNA，因此遗传物质的改造主要是在DNA上进行的。我们进行遗传物质改造，主要是在质粒（图6）上完成的，因为质粒是一种基因组外的、可以独立复制的游离DNA，其扩增比较方便，可以在细菌或酵母中进行。（详细了解质粒：《啥是质粒？从生物武器到转基因食物都跟它有关》）

图6. 质粒

感染性克隆

病毒的基因组通常比较小，因此我们可以把病毒基因组的双链接DNA副本组装在质粒中。把这些带有病毒序列的质粒DNA，或者由质粒指导转录产生的RNA送进细胞——这个过程叫做“转染”——可以指导细胞工厂产生病毒蛋白，复制新的病毒基因组，并组装释放，产生感染性病毒颗粒。

病毒的基因组可以是DNA，也可以是RNA。DNA病毒的基因组可以扩增、切割之后直接连入质粒；而RNA病毒的基因组，则需要通过RNA指导合成DNA的逆转录过程，转化成DNA之后，再连入质粒。这些携带有病毒基因组序列、可以产生感染性病毒颗粒的质粒，就称作“感染性克隆”。将构建好的感染性克隆转染到细胞中，或转录成RNA之后转染细胞，就可以产生新的病毒（图7）。

图7. 感染性克隆构建及病毒的产生，改编自维基百科

反向遗传操作系统

前面讲到，反向遗传研究的思路就是改变基因序列，从基因型出发研究表型，进而研究基因功能。对病毒也是一样：构建感染性克隆，对其进行基因工程改造，将改造后的感染性克隆转入细胞中，就能产生带有突变的病毒，然后用这些新的病毒去感染细胞或宿主，观察病毒的复制、宿主的症状等表型，就可以研究病毒相关基因的功能（图8）。这样一套系统，我们称之为病毒的反向遗传操作系统。

图8. 病毒研究的反向遗传操作系统，改编自维基百科

以最近发布的新冠病毒反向遗传操作系统为例^[1]：它是借助酵母获得感染性克隆的。首先，新冠病毒基因组RNA通过逆转录及扩增获得DNA片段，或者直接合成病毒的DNA版本，然后在酵母中重组合成感染性克隆质粒，提取质粒之后，转录合成RNA，RNA转染细胞之后，就可以产生新冠病毒了（图9）。

图9. 冠状病毒感染性克隆^[1]

不论是用于研究，还是用于疫苗或者治疗，要制作病毒，我们都需要在质粒上进行改造，改造的过程中，就会借助一些酶切位点、筛选标记、以及必要的质粒片段等基因工程工具。同时，我们的病毒序列是从天然的病毒中获取的，设计和制造感染性克隆过程中，势必会沿用现有的理论模型以及设计思路，即便是从头开始人工合成一个新的病毒，也会在密码子使用频率等等方面，留下人工痕迹。因此，一个病毒是否是人工合成的，是很容易鉴定出来的。

病毒的反向遗传操作系统，是病毒学以及相关生命科学领域中非常重要的工具，它可以用于基础研究，研究病毒中各个基因的功能，也可以用于疫苗开发，还可以将病毒作为载体，装载上不同的基因序列，用于其他生命科学研究。此外，随着生命科学的发展，病毒载体用于细胞治疗、基因治疗以及癌症治疗的前景也越来越光明。

病毒学的思路及工具在生物学基础研究中应用广泛。目前病毒载体广泛应用于基因的过表达、敲除、敲低、动物模型改造等各个方面。以病毒学研究中的假病毒应用为例（图10）：我们可以使用反向遗传操作系统的基本方法制作假病毒颗粒，令假病毒颗粒包膜上含有所研究病毒的包膜蛋白，可以用来模拟病毒颗粒的抗原性、被中和及感染早期过程；但是，颗粒内部仅含有缺陷病毒基因组或没有基因组，因此假病毒不能完成病毒的复制周期，也就不会让宿主发病。由于安全性比较好，借助假病毒颗粒，我们就可以在生物安全级别相对较低的实验室内研究一些危险的病毒。

图10. 假病毒颗粒用于冠状病毒研究（引自金斯瑞公司）

我们每个人都打过疫苗，大家可以摸一摸自己胳膊上的疤痕，那是注射卡介苗留下来的。疫苗通过刺激机体产生获得性免疫保护，从而预防疾病。根据疫苗的组分，可以分为灭活疫苗、弱毒活疫苗、类毒素、亚单位疫苗、重组蛋白或多肽疫苗，以及病毒载体疫苗、DNA或RNA疫苗等。疫苗需要同时满足两个条件：既能刺激机体产生有效的免疫保护，又要不导致疾病。接种疫苗过程，类似一场免疫系统的军事训练：在不损伤机体的前提下训练免疫系统。而所谓的免疫力，实际上就是机体在下次遇到病原时能迅速消灭病原体，让人（或动物）不发病的能力。

我们看一个反向遗传操作系统制作疫苗的例子（图11）。我们知道，流感会发生频繁的突变，每年流行的病毒毒株可能都不相同，换了“马甲”之后免疫系统就不认识它了。因此我们必须根据当年所流行的病毒株，来生产新的流感疫苗。这时就要用到反向遗传操作系统：① 我们从临床中检测到流行强毒株，获得它的抗原编码序列，② 然后通过基因工程的方式，将抗原部分的编码序列重组到疫苗弱毒株的感染性克隆中；③ 然后我们将这些质粒转染到细胞内部，就能够产生带有强毒株抗原、并且不具有致病性的、弱的新疫苗毒株，就可以用于预防当年所流行的流感。

图11. 反向遗传操作系统制作流感疫苗（来源：wikipedia，作者修改）

预防病毒病最有效的方式是研发疫苗。为了防控新冠疫情，全球科研人员都在努力研发新型冠状病毒的疫苗，我国陈薇院士团队研发的重组新型冠状病毒疫苗（腺病毒载体）（“Ad5-nCoV”）已经进入 II期临床试验。根据名字就可以知道，这个疫苗所使用的病毒载体是腺病毒，腺病毒是一种没有包膜的DNA病毒，我们将腺病毒中能够导致疾病的基因以及一些无关的基因删除掉，然后重组引入新型冠状病毒的抗原蛋白表达基因，就制作完成了以腺病毒载体为基础的冠状病毒疫苗。腺病毒载体的特点是高效率、高滴度（滴度是指病毒的浓度）、低致病性，并且不会整合进入宿主细胞染色体，是一种常用的病毒载体。目前国内外的研究者还使用了灭活疫苗、亚单位疫苗、假病毒颗粒、痘病毒载体疫苗及纳米颗粒疫苗等策略研发疫苗 (图12)。其中，纳米颗粒疫苗是由病毒抗原及自组装蛋白组分组成的纳米颗粒。

图12. 新冠病毒疫苗研发策略

病毒或病毒载体还可以应用于噬菌体治疗、细胞治疗、基因治疗以及癌症治疗和预防。

由于各种抗生素的发现和应用，细菌对人类健康的危害大大降低了，但是，抗生素滥用带来了细菌耐药性的问题，其中有些细菌具有多重抗生素抗性，我们称之为超级细菌，超级细菌感染是非常危险的、且在医学上是非常棘手的问题，而噬菌体是可以感染细菌的病毒，因此使用噬菌体来治疗耐药菌感染成为细菌感染治疗的思路之一。2015年，加州大学的一对科学家夫妇在埃及旅游途中，丈夫Tom Patterson感染了超级细菌，生命垂危，后来使用噬菌体治疗才得以康复（图13）。

图13. 噬菌体治疗超级细菌感染

癌症是一类严重威胁人类健康的疾病，而某些病毒可以导致肿瘤的消溶，我们称之为溶瘤病毒。溶瘤病毒包含腺病毒、痘病毒、甲病毒、新城疫病毒、单纯疱疹病毒-1、麻疹病毒等（图14）。这些病毒经过改造之后，可以用于癌症治疗：一方面不导致疾病，另一方面可以杀死肿瘤细胞。溶瘤病毒治疗肿瘤的机制有多种，比如破坏肿瘤血管，切断肿瘤营养来源，直接杀死肿瘤细胞，或者诱导针对肿瘤的细胞免疫反应等等。

图14. 溶瘤病毒及其作用机制^[2]

人体内的免疫系统就像一支军队，可以抵御外来病原体的入侵，同时也可以识别并消灭异常的“叛变”细胞，而有些细胞可以躲过这种监视，不被免疫系统所识别和清除，肆意生长，这就是癌细胞。细胞治疗的方法可以借助慢病毒载体，给免疫系统的士兵——T细胞——安装上能够识别癌细胞的受体CAR，帮助免疫系统识别并消灭肿瘤（图15）。慢病毒载体是改造HIV病毒而来的，它的感染效率高，可以将外源基因稳定地插入到细胞基因组中，在细胞治疗中应用广泛。

图15. CAR-T细胞治疗

随着基因编辑技术的迅猛发展，基因治疗的前景越来越被看好。基因治疗是通过改造基因来治疗或预防疾病的，它采用的方法主要有替换突变基因，敲除有害基因，或者引入新基因。基因治疗特别适合治疗遗传病，也可以用于治疗病毒病或癌症。

“蝴蝶男孩”的康复是基因治疗的一个经典例子。2017年，一位患有交界型大疱性表皮松解症的男孩Hassan因全身皮肤严重破损而入院，他的皮肤异常脆弱，一碰就破，面临生命危险。这一种严重的遗传病，是由皮肤的层黏连蛋白基因异常所导致的，人们形象地将这位患病的孩子称为“蝴蝶男孩”。科学家把正常的黏连蛋白基因装载到逆转录病毒载体中，然后用病毒感染体外培养的皮肤细胞，这些皮肤细胞被病毒载体引入了正常的基因，从而能够表达正常的蛋白。在体外培养转基因皮肤后，把皮肤移植到小孩身体上，逐步取代原来的皮肤，达到治疗的目的（图16）。

图16. 病毒载体制作转基因皮肤治疗交界型大疱性表皮松解症^[3]

脊髓性肌萎缩是一种致死性的遗传病，患儿的脑干和脊髓中的运动神经元逐步被破坏，慢慢失去说话、走路的能力，到最后，甚至无法呼吸和吞咽，最终被夺去性命。研究发现这种疾病是SMN1基因异常造成的，美国诺华公司开发的腺病毒相关病毒载体可以将正常的SMN1基因装到病患的基因组上，从而治疗这种疾病。这种病毒载体药物只需要注射一次，而一次的费用高达200万美元（图17）。这里所使用的AAV病毒是复制依赖于腺病毒的缺陷病毒，本身不导致疾病，能够感染分裂和不分裂的细胞（神经细胞通常不分裂），可以定点整合到人19号染色体上，是一种常用的病毒载体。

图17. 史上最贵药物，用于治疗脊髓性肌萎缩的AAV病毒

病毒是导致人类疾病的重要病原体，从古到今，各种病毒都是人类的梦魇，即便是当今社会，面临新冠疫情，人类健康、经济、社会各方面依然受到极大的冲击。随着人与自然的边界愈加模糊，气候环境剧烈变迁，人或动物的国际交流运输频繁，新发病毒病永远是、而且越来越是一种极其可能发生、且已经或正在发生的、对人类社会的严重威胁。

病毒学研究让我们在新发病毒病预警、处置和防疫方面有了长足的进步，我们发现新病毒的速度越来越快，做出有效防疫措施和决策越来越快，药物和疫苗研发也越来越快。相较历史上的历次瘟疫，人类社会应对传染病的能力已经今非昔比。同时，病毒学研究也为生命科学基础研究、医学研究带来了很多令人瞩目的成果。我们常说，21世纪是生命科学的世纪，很多专家也把基因编辑为代表的生命科学技术作为第四次工业革命的主要组成部分，而这一切离不开病毒学工具。因此，病毒学研究不论从生命科学发展还是人类健康事业来说，都是非常重要的。

[1] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.21.959817v1.full.pdf

[2] Ungerechts, G., Bossow, S., Leuchs, B., Holm, P.S., Rommelaere, J., Coffey, M., Coffin, R., Bell, J., and Nettelbeck, D.M. (2016). Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development 3, 16018–13.

[3] https://www.nature.com/articles/nature24753